枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）產生多種抗 菌次生代謝產物，被認為是具有潛在的、能有效抑 制病原菌并促進動植物生長的有益菌 ，具有很 高的農用及醫用價值 。近年來，隨著我國畜牧 養殖業不斷發展，抗生素飼料添加劑造成的負面 影響嚴重影響了畜牧業的健康發展。抗菌脂肽作 為一種新型抗生素的替代品具有諸多優點，研發 和推廣綠色、安全、健康、可持續養殖發展的抗生 素替代品已成為研究方向。

LB培養基、Landy培養基 、PDA培養基為 國產分析純。

試驗菌：4株枯草芽孢桿菌分別是GD株、SF-1 株、WT株和POC-4株，均分離自不同畜禽養殖場 周邊環境土壤，由大連三儀生物工程研究所保存。 指示菌：致病性大腸桿菌 O2、金黃色葡萄球 菌（ATCC25923）、啤酒酵母菌（ATCC9763）、雞白 痢沙門菌（CVCC2218）和桔青霉（AS3.2788）等標 準菌株，由中國微生物菌株保藏中心提供。

生物安全柜（Hfsafe-1800，上海力升科學儀器有限公司）；電熱恒溫培養箱（DNP-9022，上海精宏實驗設備有限公司）；空氣浴振蕩培養箱 （HZQ-F160、HZQ-C，哈爾濱市東聯電子技術開 發有限公司）；高速臺式冷凍離心機（TGL-20M， 長沙湘儀離心機儀器有限公司）；旋渦混合器 （QL-866，江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公 司）；凝膠成像系統（UVPGDS-8000，美國 UVP 公司）；高效液相儀（DIONEX U3000，美國DION? EX公司）；液質（LC-MS）聯用儀Agilent 6540（QTOF LC/MS，美國安捷倫公司）；電熱恒溫鼓風干 燥箱（DGG-9240A，上海森信實驗儀器有限公 司）；電子天平（BS210S，北京賽多利斯有限公 司）；精密 PH 計（PHS-3C，上海虹益儀器有限公 司）；顯微鏡（XSZ-4G，重慶光電儀器有限公司）； 雙槽玻璃層析缸（薄層色譜展開槽/展開缸）（P1- 2020，上海楚定分析儀器有限公司）；全自動立式 電熱壓力蒸汽滅菌器（YXQ-LS-S2，上海博迅實業有限公司醫療設備廠）。

表面活性素（surfactin）（標準樣品，美國Sigma 公司）；大孔樹脂（XAD-16，上海寶曼生物科技有 限公司）；硅膠板（Silica Gel GF254 20 cm×5 cm， 上海科興生物科技有限公司）；5%茚三酮溶液（乙 酸∶正丁醇=5∶95），乙酸、正丁醇、甲醇、無水乙 醇、鹽酸、茚三酮等試劑（分析純或色譜純，國產）。

將各指示菌分別采用相應的固體平板培養基 進行復蘇，37 ℃培養20 h（其中真菌采用28 ℃培 養36 h），再接種于裝有50 mL LB培養液的250 mL 三角瓶，37 ℃、180 r/min培養20 h（其中真菌采用 28 ℃培養36 h），取出并通過平板計數法分別測定 指示菌數，并稀釋至1×106 cfu/mL，4 ℃保存、備用。

將4株分離株枯草芽孢桿菌分別在LB平板上 活化，37 ℃培養20 h，分別取活化的單菌落轉接于 裝有50 mL LB培養液的250 mL三角瓶中，置37 ℃， 180 r/min，培養20 h。分別將各枯草芽孢桿菌再轉 種到裝有500 mL Landy培養液的3 000 mL三角瓶 中，接種量為5%，置32 ℃，180 r/min培養，備用。

取各分離株枯草芽孢桿菌24 h發酵液進行處 理，采用管碟法 ，對致病性大腸桿菌、沙門菌，金 黃色葡萄球菌、啤酒酵母菌、青霉素等指示菌分別 抑菌效果檢測，設 3 個重復，1 個培養基陰性對 照，1個陽性對照（革蘭氏陽性菌采用桿菌肽鋅、 革蘭氏陰性菌采用硫酸黏桿菌素、真菌采用兩性 霉素，配置濃度參照中國藥典規定配制），觀測各 芽孢桿菌代謝產物的抑菌譜。

結果顯示，不同分離株的枯草芽孢桿菌產生 的抑菌圈不同，同一分離株枯草芽孢桿菌對不同 指示菌的抑菌圈大小也不同；從抑菌圈來看，對真菌效果較好（20 mm左右），對革蘭氏陽性葡萄球 菌抑菌效果明顯（≥ 20 mm），好于革蘭氏陰性菌抑 菌效果（D≈ 15~20 mm之間），其中分離株（GD）抑 菌圈達到20 mm，好于對照組。初步確 定GD株作為后續研究菌株。結果顯示：硅膠板經過層析后，直接噴灑茚三 酮染色劑后加熱，樣品及標品表面活性素在相應 部位均沒有顯示，說明樣品和標品中均沒有游離 氨基酸存在，分子結構均為環狀結構；采用濃HCl 進行原位水解后，在相應部位能見到標品及樣品 的痕跡，再用茚三酮染色后，在對應位置處樣品和 標品均能顯色，說明樣品和標品中已有游離氨基 酸存在，環狀分子結構結構均已經打開。薄層板上樣品與標品兩個顯色斑點所處的位置 比較表明，它們遷移的速度一致。初步判斷該GD 株產生的抗菌產物與標品屬于同一類脂肽化合物， 即表面活性素（urfactin）或表面活性素的同系物。

不同的芽孢桿菌產生的抗菌物質對不同指 示菌有不同的抑菌效果，對同種指示菌也有不 同的抑菌活性；同種芽孢桿菌產生的抗菌物質對不同指示菌有也有完全不同的抑菌效果。根據研 究資料顯示，枯草芽孢桿菌、淀粉液化芽孢桿菌 （B. amyloliquefaciens） 、短小芽孢桿菌（B. pum? ilus） 、地衣芽孢桿菌（B. lichemformis） 、蠟樣芽 孢桿菌（B. cereus）、蘇蕓金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis） 、類芽孢桿菌（Paenibacillus）和 環狀芽孢桿菌（Bacillus circulan）等均能產生抗 菌物質，產生的抗菌物質是否類似、以哪一種為主 要組分，有待于進一步研究。

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