骨關節炎( OA) 屬于中醫學痹證的范疇，好發于 老年人，以軟骨退變和關節周圍骨質增生、細胞外基 質( ECM) 代謝失調為主要的病理特征，軟骨變性是 OA 的最基本病理改變，臨床上表現為關節的疼痛、 僵硬、肥大及功能活動受限等 。臨床上應用補腎 益肝活血方治療 OA 療效顯著，取得良好臨床效果， 并通過實驗探討了該方對軟骨細胞凋亡、骨髓基質 細胞( BMSCs) 分化的影響，發現補腎益肝活血方有 抑制軟骨細胞凋亡的作用，其含藥血清能有效誘導 BMSCs 成軟骨細胞分化，其作用機制很可能與細胞 外信號調節激 酶 ( EＲK) 和絲裂原活化蛋白激酶( MAPKs) 存在相關聯系。本研究旨在分析補腎益 肝活血方對 OA EＲK/p38MAPKs 信號通路產生的 影響，探究 OA 發生機制及 OA 治療中的機制。

1 材料與方法

1. 1 實驗材料

1. 1. 1 實驗動物

選取健康的、成年 SPF 級雌性 SD 大鼠，重量 185 ～ 230 g，實驗用動物全部由南京 中醫藥大學研究所提供。為了使這些大鼠適應周圍 環境，納入本實驗的所有 SD 大鼠均于實驗前 1 w 放 置在實驗室內，飼養員進行常規的分籠飼養。實驗 室基本指標: 保持自然光照，良好的通風，室內溫度 要求控制在 18. 5～23. 0℃，濕度控制在 40% ～ 70%。 實驗研究期間，所有大鼠進食標準顆粒詞料，并可以 自由地飲用自來水，術前 8 h 禁食水。

1. 1. 2 主要試劑、儀器與藥品

胎牛血清( FBS，Gibco 公司) ; DMEM 低糖培養基( Hyclone 公司) ; 雙抗混合液( 100 U/ml 青霉素、100 μg /ml 鏈霉素) ，10%胰 蛋白酶、0. 2%Ⅱ型膠原酶( Sigma 公司) ; 逆轉錄試劑盒 ( Fermentas 公司) ; 引物合成( 上海生工生物工程公司) ; 磷酸化-絲裂原活化蛋白激酶 p38 抗體( Anti-pp38α，Thr180/Tyr182) 一抗( Millipore 公司) ; p38 一抗 ( Millipore 公司) 。二氧化碳培養箱、熒光倒置顯微 鏡、流式細胞儀、酶標儀、濾器、無菌操作臺和掌上迷你離心機。補腎益肝活血方由骨碎補 15 g、丹參10 g、沒 藥 10 g 及懷牛膝 10 g 組成，實驗所用藥物由南京中醫藥大學附屬省中西結合醫院藥劑科提供。

1. 2 實驗動物分組

40 只雌性 SD 大鼠隨機分為 4 組，即對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，每 組各 10 只。

1. 3 補腎益肝活血方含藥血清的制備

根據人和 動物間按體表面積折算的等效劑量比率表換算，給 藥組給予補腎益肝活血方 3. 2 g /( kg·d) 灌胃，對 照組則給予等量的生理鹽水灌胃。各組每 12 h 灌 胃給藥 1 次，連續灌胃 5 d。并在最后一次灌胃前禁 食，末次灌藥 3 h 后，麻醉 SD 大鼠，行腹主動脈采 血，靜置于溫度預調在 4℃ 的冰箱 4 h 后，離心機設 置 2 500 r/min 的轉速，離心 25 min，分離離心所得 血清，將同組實驗動物分離所得到的血清予以混合， 并在 56℃ 水浴箱內，滅活 30 min，抽濾、除菌后分 裝，－20℃保存備用。

2 結 果

體外分離培 養的原代軟骨細胞外觀近似圓球的形狀，呈懸浮狀 態，折光性較好，在接種后的 12 h 左右，開始貼壁生 長，當軟骨細胞在壁上生長 24 ～ 48 h，大部分軟骨 細胞貼壁伸展，形狀多呈現出三角形、扁平形及多角 形，部分細胞出現分裂相。甲苯胺藍染色后可見 細胞核呈深藍色，有 1～2 個核仁，胞質呈淡藍色，細 胞外基質著淺藍色。軟骨細胞的胞質經異 硫氰酸熒光素( FITC) 染色后發出鮮亮的綠色熒光， 呈強陽性，細胞核區域沒有著色。細胞核經 4＇，6-二 脒基-2-苯基吲哚( DAPI) 染色后激發出藍色熒光。幾乎全部細胞表達了Ⅱ型膠原， 進一步證明本實驗得到了純度很高的軟骨細胞。

3 討 論

OA 是一種退行性變的疾病，好發于老年人，據 統計，我 國 40 歲以上人群原發性 OA 患 病 率 為 46. 3% 。OA 的特征性改變是軟骨的退變和關節周圍骨質的增生，實驗室表現為進行性的關節軟骨 破壞和骨贅的形成，軟骨變性是 OA 的最基本病理 改變 。OA 可同時伴有不同程度的滑膜炎癥，最 終可以出現關節的疼痛、僵硬、肥大及功能活動等受到限制 。關節軟骨的退變與破壞是 OA 最主要 的病理環節，軟骨組織內只有一種細胞成分，就是軟 骨細胞，而軟骨細胞在體內不增殖 。為了本研 究的進一步進行，本研究采用體外實驗的實驗方法， 用 SD 雌性大鼠肋骨的軟骨細胞進行體外細胞培養。