在RhD（-）血液樣本中存 在20%左右的Del型，其具有完整的RHD基因，Del型 個體在接受D抗原致敏后不會產(chǎn)生同種不規(guī)則抗-D抗 體。當個體按血清學標準診斷時，需要按RhD（-） 者頻繁進行抗- D檢 測，甚至還要輸注R h免疫球蛋 白。而對于RhD（-）孕婦來說，這無疑增加了其心 理、經(jīng)濟負擔。因此，對RhD（-）孕婦進行基因分型，可以更準確的判斷其Del表型，為臨床檢測、診 斷及輸注提供更有效的保證。本文主要收集廣州番禺 城區(qū)范圍內(nèi)的RhD（-）孕婦樣本進行血清學和基因 分型研究，從分子水平分析RhD（-）的各種表型， 補 充RHD基因檢測本地數(shù)據(jù)庫，以期指導臨床孕婦 RhD（-）檢測、準確鑒定Del分型，減少RhD（-）孕 婦不必要的頻繁的抗-D效價檢測和Rh免疫球蛋白預 防性輸注。

資料與方法

1研究對象

收集2015年1月~2017年12月的本地區(qū)醫(yī) 院孕婦初篩RhD陰性18例血標本，年齡22~40歲，平 均年齡31歲。用EDTA-K2抗凝試管留取2~5mL全血。

2 試劑與設備

2.1 試 劑

IgG+IgM型 抗- D（法 國DIAGAST公 司 生 產(chǎn)，批 號BMJ 1204D）；IgM型單克隆抗- D試 劑 （德國Biotest公司生產(chǎn)，批號1029060）；IgG型單克隆抗- D試 劑（上海血液生物醫(yī)藥有限責任公司， 批號20151224）。血基因組DNA提取試劑盒（天津 秀鵬生物技術開發(fā)有限公司，批 號201708010）； R H基因變異體基因分型檢測試劑盒（天津秀鵬生 物技術開發(fā)有限公司，批 號201708010）；電泳緩 沖液（1×TBE天津秀鵬生物技術開發(fā)有限公司, 批 號201708011）；瓊脂糖（北京康為世紀公司, 批號 06910K）。

2.2 設備

低速離心機（北京醫(yī)用離心機廠），高速 離心機（北京白洋離心機廠），水浴箱（上海博訊公司），渦旋振蕩器（其林貝爾公司），9700型PCR擴 增儀（美國ABI公司），電泳儀（北京六一儀器廠）, 水平電泳槽（北京六一儀器廠），凝膠成像系統(tǒng)（珠 海黑馬公司）。

3 檢測方法

3.1 血清學方法

RhD（-）確認（試管法）：取三個 不同廠家IgG或IgG+IgM性質(zhì)的抗-D試劑100μL，分 別與受檢者5%紅懸液5 0uL混勻，O型RhD陰、陽性 紅細胞作為對照管，于37℃溫水中孵育1h，然后以生 理鹽水洗滌3次，去除上層清液，每管加入100μL抗 人球蛋白試劑，離心機離心6 0s，速度1 000r/min。 結(jié)果判定：檢測管出現(xiàn)凝集現(xiàn)象則為陽性，反之為 陰性。需3種抗-D試劑均檢測為陰性才能確定樣本為 RhD（-）。Del表型鑒定：對確認為 RhD（-）的標 本，另外再取紅細胞標本以IgG抗-D進行吸收，并采 用酸放散試驗，當吸收放散試驗結(jié)果陽性時表明標本為Del表型。

3.2 血型基因組DNA提取

使用高速離心機、水浴 箱、渦旋振蕩器等設備，嚴格按照天津秀鵬生物技術 開發(fā)有限公司生產(chǎn)的全血基因組DNA提取試劑盒說明 書操作，對抗-D篩查陰性的樣本提取基因組DNA備 用。

3.3 基因分型

根據(jù)RH基因變異體基因分型檢測試 劑盒，在擴增儀上進行基因分型試驗。將將100μL dNTP-Buffer濃縮液、140μL去離子水 、2.0μL Taq 酶（5units/μL）和 2 5μL樣本DNA共267μL混合 液；向每個引物孔（1~24孔）各加入10μL上述混合 液。擴增循環(huán)參數(shù)：96℃ 2 min ，1 cycle ；96℃20 S/68℃60S ，5 cycles； 96℃20 S/65℃50S /72℃45 S，1 0 cycles；9 6℃2 0 S / 6 2℃5 0 S / 7 2℃4 5 S，2 5 cycles； 72℃2min，1 cycle。吸取5μL擴增產(chǎn)物， 加入配制好的2%瓊脂糖凝膠中并進行電泳，電泳參 數(shù)設置為電壓100V，時間15min。電泳后用凝膠成像 儀進行拍照、記錄與分析。基因分型的結(jié)果判斷見表 1。

結(jié) 果

1 RhD（-）確認及DeL表型檢測 用含有IgG型抗-D 檢測紅細胞標本時，18例初篩RhD（-）標本中， 18 例標本均確定為血清學RhD（-），吸收放散試驗 中確定4例DeL表現(xiàn)型（占2 2 .2%），其 中3例CCee （16.7%）、1例ccEE（5.6%）。具體見表2。



討 論

RhD（-）個體可能產(chǎn)生抗-D，該抗體可引發(fā)嚴 重的HDN甚至胎兒死亡。因此對于孕期婦女來說，為 了盡量避免胎兒宮內(nèi)及新生兒溶血的發(fā)生，需要密切 監(jiān)測孕婦體內(nèi)抗-D，必要時需輸注Rh免疫球蛋白進 行阻斷。臨床上通過血清學檢測的RhD（-），可能 部分個體并非外顯子全缺失，而是由于部分缺失或某 個堿基變異導致。目前國內(nèi)常見的RHD基因分型 主要有放散D(DEL）、部分D與弱D等變異型，DEL 型作為國內(nèi)外較常見的RHD變異型，其分子機制已被 報道。DEL的RHD變異型基因在第9處外顯子有一處 末位堿基突變，促使RNA轉(zhuǎn)錄時內(nèi)含子被錯誤剪切，導致無法正常表達RHD蛋白。



 

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